Vibrio anguillarumおよびその感染症に関する研究

(本論文はすでに発表した実験結果に未発表の実験結果を付け加えてまとめたものである。)
第I章
アユおよびその他の養殖魚の病魚からVibrio anguillarumを分離し,我が国における本菌感染症を確認した。
1) 浜名湖産稚アユは採捕後の蓄養期間中における歩留りが著しく悪いが,その斃死原因には,主として蓄養初期の死亡をもたらす物理・化学的要因と,主として蓄養開始後3日目頃からの死亡をもたらす細菌感染症の2つのものがあることが確認された。
2) 前者の死亡は淡水順化を短時間に実施することにより,後者の死亡はchlortetracycline薬浴を行なうことにより,それぞれかなり抑えることができた。
3) 後者の細菌感染症には1種類の細菌が関与していることがわかり,また稚アユは蓄養水槽に収容した時点ですでにその病原菌の感染を受けていると考えられたが,感染している個体の比率,あるいは感染を受けている組織(初感染部位)を明らかにすることはできなかった。
4) 1965年,1966年および1967年に浜名湖産稚アユ病魚から分離された病原菌(11株)は,その形態学的および生化学的性状からいずれもVibrio anguillarumと同定された。
5) 利根川河口産稚アユ(1967年)および静岡県伊豆の海産稚アユ病魚(1970年)からV. anguillarumが分離され,各地の海産稚アユの歩留りの不良には多くの場合本菌感染症が関与しているものと考えられた。
6) 1969年夏,滋賀県彦根周辺および長野県佐久地区の淡水養殖アユ(琵琶湖産種苗)にビブリオ病が発生し,いずれの病魚からもV. anguillarumが分離され,完全なる淡水域にも本菌感染症が存在することが確認された。
7) 1973年,全国的に養殖アユのビブリオ病が流行し,徳島県,岡山県および愛知県下の病魚からV. anguillarumが原因菌として分離された。この年の流行は,従来は本病に対し有効であった治療薬(サルファ剤ならびにchloramphenicolなどの抗生物質)の効果がほとんど認められないことから大きな被害をもたらした。同年の分離菌株はin vitro試験によってもこれらの薬剤にかなり耐性化していることが示された。
8) このようなV. anguillarumの薬剤耐性化は薬剤の過度の使用がもたらしたものと考えられ,抗菌剤による本病の予防・治療対策には大きな問題のあることが指摘された。
9) 1971年,徳島県松茂町の養鰻池においてニホンウナギの本菌感染症が確認され,以後同地区の塩分を含む養鰻池には継続して本病が存在した。
10) 1965年および1966年,愛知県伊川津において実験を目的として海水に蓄養されていたニホンウナギから本菌が分離された。
11) 1966年,浜名湖において海水順化試験を行なったニジマスに本菌感染症が発生した。
12) 1966年,静岡県沼津の養殖ハマチおよびカンパチ,1972年島根県神西湖の天然ボラなどの病魚から本菌が分離された。
13) 岡山県水産試験場で行なっているアユの種苗生産においてビブリオ病による著しい減耗が大きな問題となっており,その原因菌はV. anguillarumであることが確認された。(1973年,1974年)。
14) 魚の本菌に対する感受性,魚の一般的な抵抗力,および種苗の取り扱い方などを総合してみると,アユ特に海産稚アユに本菌感染症が多発するのはかなり必然的なことであると考えられ,アユのビブリオ病を抑えるためには根本的な養殖方式の再検討が必要と考えられた。

第II章
著者がこれまでに分離したV. anguillarumについて,その性状を整理し,それらと外国から分離・報告された本菌の性状を比較するとともに初めてBergey's manual of determinative bacteriology(8th ed. 1974)に記載された本菌のtype descriptionについて考察を加えた。また我が国で報告された他のfish-pathogenic vibrios,更にはVibrio parahaemolyticusあるいはVibrio alginolyticusと本菌の性状との比較を試みた。
15) 1965年から1974年にかけて,アユ,ニホンウナギ,ニジマス,ハマチ,カンパチおよびボラから分離したV. anguillarum 61菌株の性状を整理したところ,糖分解能その他でいくつかの相違点はあるにしても主要な項目およびウナギに対する病原性などの点で完全に一致した。それらの性状を新しいBergey's Manualのtype descriptionと比較した結果,すべての分離株はV. anguillarumと同定しうることが再確認された。
16) 著者の分離株の性状および外国から報告されたV. anguillarumの性状を総合して検討した結果,Bergey's Manualのtype descriptionにはindole産生能についての記載など,若干訂正されるべき点があると考えられた。
17) Bergey's Manualに記載されたように,Vibrio piscium, V. piscium var. japonicusおよびV. ichthyodermisをV. anguillarumのsynonymとすることは現段階では一応妥当なことと考えられたが,今後特に本菌の病原性についての検討を行ない,将来は生化学的性状だけでなく病原性の違いをも考慮して本菌をいくつかのtypeに分ける必要があると考えられた。
18) 我が国で他の研究者により報告された種名の明らかにされていないfish-pathogenic vibriosの性状を検討したところ,ニジマスにはV. anguillarumとは別種の病原菌も存在していると考えられ,また海産魚の潰瘍病の原因菌をそのままV. anguillarumとすることには問題があると考えられた。
19) V. anguillarumとV. parahaemolyticusを比較検討したところ,arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, sucrose利用,Voges-Proskauer reaction,塩分耐性などの生化学的性状,およびウナギに対する病原性に違いのあることが確認された。
20) V. anguillarumとV. alginolyticusを比較したところarginine dihydrolase, lysine decarboxylase塩分耐性およびウナギに対する病原性などに違いのあることがわかった。

第III章
V. anguillarum (PB-15株,アユ由来)に対する数種淡水魚および海産魚の感受性を検討したのち,ニホンウナギを実験材料魚に選び,病原性確認の実験方法について検討した。この接種実験の過程において,接種菌量のわずかな違いによって90%以上のウナギが死亡する場合とまったく死亡魚が出ない場合があったので,その現象に着目し,接種菌の動態および接種した魚の内的変化を明らかにすることによりhost-parasite relationshipの一局面をとらえてみた。
21) V. anguillarumを数種の淡水魚および海産魚に接種したところ,ニホンウナギ,ヨーロッパウナギおよびドジョウは本菌に対し高い感受性を示し,ニジマス,クロダイおよびハマチも比較的高い感受性を示したが,コイ,フナおよびキンギョは極めて低い感受性しか示さなかった。
22) 感受性が高い点や飼育が比較的容易であることなどからニホンウナギを本菌の病原性確認の材料魚として選び,感染方法を検討したところ,接触法(培養菌水中懸濁法)あるいは経口投与法によっては発病させることができず,注射法,それも筋肉内注射が最も確実に発病させうる接種方法であることがわかった。
23) 発病を目的として筋肉内注射を行なう場合,接種菌量は魚体重100g当り1㎎(湿菌重量,生菌数8×108 cells)が適当であること,魚は体重10g以上であれば大きさにあまり関係なく材料魚として使用しうること,水温は10℃でも実験可能であるが20℃が適当であることがわかった。
24) ニホンウナギに本菌(PB-15株)を魚体重100g当り1㎎を接種すると90%以上のウナギが死亡したが,接種量を0.1㎎とすると死亡魚は1尾もでなかった。
25) 1㎎を接種されたウナギの血液,肝臓,脾臓および腎臓において接種菌は徐々に増加し,死亡寸前(接種36時間後)の菌数は106/ml or gのlevelに達していた。これに対し0.1㎎を接種されたウナギの各組織中の接種菌の数は時間経過とともにすみやかに減少し,72時間後にはほぼ消失していた。
26) 1㎎を接種されたウナギおよび0.1㎎を接種されたウナギのいずれにおいても,hematocrit値,hemoglobin量あるいは赤血球数における変化は認められなかった。
27) 白血球の変動においては,1㎎を接種されたウナギと0.1㎎を接種されたウナギの間には大きな違いが認められた。特に菌接種6時間後に急激に増加した好中球は,前者のウナギ(1㎎接種)ではその後減少し続けたのに対し,後者のウナギ(0.1㎎接種)では更に増加し,好中球が本菌の処理に大きく関与していることが示唆された。
28) 病理組織学的に検討を加えた結果,接種された菌は接種部位の筋肉組織および結合組織において増殖し,それが血流に乗り各組織に運ばれ全身感染をひき起こし,典型的な敗血症をひき起こしていることが確められた。
29) 本菌を超音波処理した上澄み液にはウナギに対する毒性成分は認められなかった。
30) 本菌は多くの場合マウスに対する病原性を示さなかった。実験によっては病原性を示す菌株もあったが,その程度はV. parahaemolyticusのマウスに対する病原性に比べると弱く,本菌は一般的にはマウスにほとんど病原性を示さないと考えられた。

補
ニホンウナギを材料魚に用い,本菌感染症の予防法の検討を目的として免疫学的基礎実験を試みた。
31) 本菌の死菌をウナギに筋肉内接種すると,凝集素抗体が産生され,生菌接種攻撃に対しても顕著な防禦作用を発揮した。
32) 死菌接種免疫によるウナギの抗体産生には水温が大きく関与することが確められた。すなわち水温11℃ではウナギは抗体を産生せず,水温15℃以上で抗体を産生しその速度は水温が高い程増した。しかし水温を27℃にまで上げても抗体産生の速度は水温23℃の場合と変わらず,水温23～27℃位がニホンウナギの抗体産生のための好適水温であると考えられた。
33) 水温23～27℃の場合,通常最初の免疫から2週間後に凝集素抗体が初めて確認されたが,最も早い例では1週間後に確認された。また維持の点では,Freund's incomplete adjuvant vaccineを接種し水温7～15℃の下においた場合,最初の免疫から約4カ月後でも抗体が確認された。
34) 経口免疫実験を試みたところ,merzonin死菌投与区においては抗体は産生されなかったが,生菌投与区においては低いtiterながら凝集素抗体の産生が認められた。なおそれらの抗体を産生した生菌投与区の魚に生菌攻撃を試みたが,あまり顕著な防禦作用は認められなかった。

Part I
Vibrio anguillarum was identified as the causative organism of epizootics of vibriosis in Ayu (Plecoglossus altivelis) and in some other fishes cultured in Japan.
1) In every spring from 1965 to 1967, young Ayu, which were caught in Lake Hamana, a salt lake, as seed fish for pond-culture, showed heavy mortalities during the period of acclimatization to freshwater. A considerable part of the mortalities was caused by an infectious disease. The causative bacterium of this infection has been identified as Vibrio anguillarum.
2) In 1967 and 1970, similar disease occurred in stocked young Ayu caught in an estuary of the River Tone and along the sea-shore of some other districts, respectively. V. anguillarum was isolated from these diseased fish in each case.
3) In the summer of 1969, an epizootic occurred in Ayu in freshwater ponds in Shiga and Nagano prefectures. The causative organism was identified as V. anguillarum. Since these fish were caught as seed in Lake Biwa, a freshwater lake, this was the first time for the bacterium to be isolated as the etiological agent from Ayu which had exclusively inhabited freshwater environments.
4) In 1973, Vibrio anguillarum infection was prevalent in Ayu in freshwater ponds in various parts of Japan, and led to heavy losses due to the ineffectiveness of sulfa drugs and antibiotics, which had been frequently used before in controlling efficiently.
5) In 1971, V. anguillarum was isolated from the diseased eel (Anguilla japonica) cultured in freshwater ponds in Tokushima prefecture. The water of these ponds contained a slight amount of sea-water. Ever since then, this infection of cultured eel has repeatedly occurred in that district. In contrast, such infection has never been observed so far in eel ponds in other districts of Japan.
6) From 1966 to 1974, V. anguillarum was isolated occasionally also from diseased specimens of such fishes in sea- or brackish waters, as cultured rainbow trout (Salmo gairdneri), yellow tail (Seriola quinqueradiata) and Kampachi (S. purpurascens), and wild grey mullet (Mugil cephalus).
7) As described above, vibriosis has recently become a serious problem in fish culture, especially in Ayu culture in Japan. It is wished that the actual method of Ayu culture should be examined radically anew, in view of controlling the occurrence of this infectious disease.

Part II
The microbiological characteristics of V. anguillarum isolated by the present author were studied comparatively and comprehensively. The type description of V. anguillarum listed in Bergey's manual of determinative bacteriology (8th ed. 1974) was discussed on the basis of the characteristics of the strains isolated by the present author and some other strains reported by foreign workers. Furthermore, some comparative studies of the present strains of V. anguillarum with other fish-pathogenic vibrios reported in Japan, and also with Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus were carried out.
8) The characteristics of V. anguillarum isolated from various fishes as described in the previous part proved to be identical with each other (not serologically), and these isolates were reaffirmed to be classified as V. anguillarum in referrence to Bergey's new Manual.
9) From investigations of the present isolates, it seems necessary to revise the type description of V. anguillarum in the Manual for some items such as indole production, growth at 5℃ and some sugar utilizations.
10) It seems reasonable to combine V. anguillarum, Vibrio piscium, V. piscium var. japonicus and Vibrio ichthyodermis as a single species, under the name of V. anguillarum. At the same time, however, it is suggested that V. anguillarum should be divided into separate types on the basis of the differences in pathogenicity and in some biochemical characteristics.
11) It was indicated that some vibrios from rainbow trout and marine fishes in Japan, as reported by other authors, can be differentiated from V. anguillarum by certain biochemical characteristics and by their pathogenicity.
12) From comparative experiments, it was demonstrated that V. anguillarum differs from V. parahaemolyticus in the following points; arginine dihydrolation, lysine decarboxylation, sucrose fermentation, Voges-Proskauer reaction, NaCl-tolerance and pathogenicity for the eel. Likewise, V. anguillarum differs from V. alginolyticus by arginine dihydrolation, lysine decarboxylation, NaCl-tolerance and pathogenicity for the eel.

Part III
The Japanese eel (A. japonica) was selected as test-material for the evaluation of pathogenicity of V. anguillarum, and a method to confirm the pathogenicity was sought for. In the latter section of this part, some host-parasite relationships in experimental infection were investigated.
13) Susceptibilities of several freshwater and marine fishes against V. anguillarum (strain PB-15, from Ayu) were tested by means of intramuscular injection. As a result, it appeared that the Japanese eel, the European eel (A. anguilla) and loach (Misgurnus anguillicaudatus) possess a remarkable susceptibility; that rainbow trout, black sea bream (Mylio macrocephalus) and yellow tail have a relatively high susceptibility too, but that carp (Cyprinus carpio), goldfish (Carassius auratus) and crucian carp (C. carassius) have a low susceptibility.
14) On account of this high susceptibility and for practical convenience, the Japanese eel was chosen as the test-material fish, and a method for the evaluation of pathogenicity was sought. The conclusions were as follows: intramuscular injection proves to be the most reliable method and 1 mg of the bacterium in wet weight (8×108 　cells) per 100 g of fish body weight is the adequate dose for inoculation. Even small eels (more than 10 g in body weight) can be used as materials. The experimental results can be obtained by a water temperature of 10℃, but show up more rapidly at 20℃.
15) Under the above mentioned experimental conditions, more than 90% of the Japanese eels that received a dose of 1 mg of cells of the bacterium died within a week, while none of the eels that received only 0.1 mg died. It was confirmed that the number of the bacterium in the blood and in some other tissues of the former eels augmented slowly up to 106 cells/ml or g; and that on the contrary, the bacterium in the latter eels diminished in number and at 72 hours after the inoculation the bacterium disappeared in every tissue.
16) From hematological studies of the inoculated eels, it was proved that no change had occurred in the hematocrit value, the hemoglobin content and the number of erythrocyte, even for the eels that had received a lethal dose (1 mg). But changes in number of leucocytes, especially of neutrophil, were markedly contrasted between the eels that received 1 mg and those received 0.1 mg.
17) From the histological studies, it could be shown that the eels which had received a lethal dose fell into a systemic septisemia.
18) A supernatant fluid of the sonicated cell suspension of the strain PB-15 was proved to have no toxic effect on the eel.
19) Most of the strains of V. anguillarum showed no pathogenicity for mouse, but in a few 'experiments some strains exhibited pathogenicity, though weaker than that of V. parahaemolyticus.

Supplementary part
Some immunological laboratory experiments were carried out, using the eels as test-material.
20) The eels produced agglutinins and protective immunity by receiving the merzonin-killed cells intramuscularly.
21) Water temperature played an important role on the formation of antibodies in the eel; within a temperature range from 15℃ to 23℃, the maximum titer, viz. 800～1,600, were attained more rapidly at higher temperature, but no difference was found between 23℃ and 27℃. No measurable antibody was produced at 11℃.
22) The agglutinating antibody induced by Freund's incomplete adjuvant vaccine were maintained for about 4 months at a low temperature of 7 to 15℃.
23) An attempt was made on oral immunization of the eel against V. anguillarum. The group fed on merzonin-killed cells did not produce antibodies, but the group fed on viable cells produced circulating agglutinating antibodies after three month's feeding. It was shown that the protective immunity of the eel fed on viable cells was very weak however, even after four month's feeding.