ヒト肺癌に対するモノクローナル抗体の作製と臨床診断への応用に関する研究

Monoclonal Antibodies to Human Pulmonary Carcinoma and Their Application to Clinical Diagnosis

河野 修興

肺癌の血清診断に応用可能な肺癌関連抗原を認識するモノクローナル抗体を得る目的で細胞融合をおこない,血清中及び胸水中の肺癌関連可溶性抗原を認識するKL-3抗体(IgM)及びKL-6抗体OgGi)を作製した。

これらはヒト肺腺癌由来細胞株VMRC-LCRをBALB/Cマウスに免疫し,その牌細胞とマウス骨髄腫細胞株P3-NS 1-Ag 4/1とをポリエチレングリコールを使って融合し,クローニングをくり返すことによって作製した。これらの抗体の特異性の検討及び臨床応用を試み,以下の結論を得た。

1)細胞抗原をトリプシン,プロナーゼ及びノイラミニダーゼなどの酵素あるいは過ヨーソ酸で処理した後に,モノクローナル抗体との結合を検討することにより抗原の生化学的性状を検討した。KL-3抗体の認識する抗原はトリプシン,プロナ-ゼ及びノイラミニダーゼに抵抗性で,過ヨーソ酸に感受性を示したことにより, KL-3抗体は末端がシアル化されていない糖鎖を認識しているものと考えられた。一方, KL-6抗体の認識する抗原は過ヨーソ酸,ノイラミニダーゼに感受性を示し,プロナーゼに軽度ながらも感受性を示したことから末端がシアル化された糖鎖で,抗原分子の一部に蛋白部分を含んでいるものと推定された。

2)可溶性抗原の分子量は,胸水をゲル濾過した各フラクション中の抗原をモノクローナル抗体を使ったサンドイッチ酵素抗体法で定呈することにより検討した。KL-3抗原及びKL-6抗原の分子量はともに100万以上であった。

3)酵素抗体法により培養株化細胞に対する反応性を検討したところ,肺癌由来細胞に対しては,KL3抗体は腺病及び小細胞癌に反応し,扁平上皮癌由来細胞には反応しなかった。 KL-6抗体は,これら3種の組織型由来細胞に反応を示した。肺癌以外の悪性腫瘍由来細胞に対する反応性は,KL-3抗体とKL-6抗体で異なるもののSarcoma細胞を含む多種の細胞株と反応をみとめた。

4)免疫ベルオキシダーゼ法により凍結組織切片を染色し反応抗原の組織分布を検討した。KL3抗原は肺癌では腺病と小細胞癌に表出されていたが,扁平上皮癌では検出されず,これらの組織型の鑑別に意義あるものと思われた。一方,KL-6抗原はこれら3種の組織型の肺癌に表出されていた。肺癌以外の病における両抗原の分布は疑似し,ほとんどの腺癌及び一部の扇平上皮癌にみとめられた. KL-3抗原及びKL-6抗原はともに正常組織に汎く分布していたが,正常肺ではKL-3抗原は細気管支上皮のみに存在し, KL-6抗原は肺胞,細気管支,気管支腺上皮に分布していた。健常者血球に対する反応性は,末梢血単核球及び額粒球に対しては蛍光抗体法で,また赤血球に対しては凝集反応で検討したが, KL-3抗体及びKL-6抗体ともにこれらの血球に対して反応をみとめなかた。

5)種々の疾患において胸水中に浸出する細胞に対する両抗体の反応性を蛍光抗体法で検討した。両抗体とも血球や活動性中皮細胞などの癌細胞以外の細胞画分には反応しなかったが, KL-3抗体は胃癌(1/1),膵癌(1/1),悪性中皮腫(1/1)由来の細胞と反応し, KL-6抗体は肺腺癌(7/8),肝癌(1/1),悪性中皮腫(1/1)と強く反応した。従って胸水中癌細胞の検出を目的とした免疫化学検査に応用可能と考えられた。

6)血清KL-3抗原は肺癌において有意な増加をみとめなかった。しかし胃癌や膵癌では,それぞれ10.5% (2/19)及び36.4% (4/11)の陽性率をみとめ,これらの疾患における腫瘍マーカーとしての性格が示唆された。

7)血中KL6抗原の平均値は,健常人(80例)278±152u/ml,肺癌(99例)895±2411u/ml,良性肺疾患(108例)492±421u/mlであった。肺癌全休での陽性率は32.3%(32/99)であり,組織型別には腺癌40.5%(17/42),扇平上皮癌32.1%(9/28),小細胞癌17.9%(5/28)が陽性であった。腺癌と扇平上皮癌では臨床病期Ⅲ及びⅣの症例で増加が顕著であった。また血清KL-6抗原はCEAやCA19-9と異なった動きを示し,これらとのcombinationassayを行うことにより肺癌診断における陽性率を改善した。

血清KL-6抗原は,揮癌や乳癌でもそれぞれ44.4%(4/9)及び75%(6/8)と高率に陽性であった。

一方、血清KL-6抗原は,一部の良性肺疾患すなわち肺線維症,びまん性細気管支炎,肺結核などでも高率に陽性であった。しかしながら,炎症の指標としての赤沈値やCRP値とは相関を示さず,良性肺疾患のなかでも急性肺炎や慢性気管支炎などでは増加をみとめないため,ある種の良性肺疾患の新しいマーカーとしても臨床的有用性を認めるものと思われた。

8)肝腺病由来胸水中のKL-3抗原は,その52.9%(10/19)が異常高値を示し, KL-6抗原は76.5%(13/17)が陽性であった。更にKL3抗原あるいはKL-6抗原の少なくともいずれかが陽性を示した症例は94.1%(16/17)の高率であった。一方,肺結核,コレステリン胸膜炎による胸水での陽性率はわずかに12.5%(2/16)であり,胸水をきたす疾患の鑑別にもKL-3抗原及びKL-6抗原の定量は有用であると考えられた。

Two monoclonal antibodies (KL-3 & KL-6) were produced by fusing murine myeloma NS 1 cells with splenocytes from a BALB/c mouse immunized with human pulmonary adenocarcinoma VMRC-LCR cells and their specificity and diagnostic potential were assessed as follows:

1) Immunohistochemical analysis of frozen tissue sections showed that KL-3 antibodies (IgM) preferentially react with lung adenocarcinomas and small cell carcinomas, whereas KL-6 antibodies (IgGi) react with these as well as squamous cell carcinomas of the lung. Both of these antibodies also react with many different types of cancer tissue and normal epitheha, but not with blood cells.

2) An enzyme immunoassay was used to study the reactivity of KL-3 and KL-6 antibodies against cancer cell lines and showed that both antibodies had similar specificities against tumor cell lines derived from the lung as those noted above for lung cancer tissues, although their reactivity against cell lines derived from other organs did not always reflect that observed for the corresponding cancer tissue.

3) Immunofluorescence was used to demonstrate that KL-3 was only reactive with tumor cells in pleural effusions from patients with mesothehoma, and pancreatic and gastric carcinoma which had metastasized to the lung, whereas KL6 reacted with malignant pleural effusion cells from the vast majority of lung adenocarcmoma cases and from lung small cell carcinoma, mesothelioma and metastiatic pancreatic carcinoma cases. None of antibodies reacted with cells in pleural effusions from patients with lung squamous cell carcinoma and nonmahgnant diseases.

4) The antigen determinants recognized by both KL-3 and KL-6 antibodies appear to be carbohydrate in nature, with terminal siahc acid only being involved in the reaction with KL-6. The molecular weights of both soluble antigens in pleural effusions were found by gel filtration to be greater than 1,000 kDal.

5) These antibodies were useful for detecting soluble antigens in sera and pleural effusions using sandwich ELISA. While elevated levels of KL-3 antigen in sera were found only in those of patients with gastric and pancreatic cancer, KL-6 antigen was above normal levels in sera of patients with lung cancer, especially advanced adenocarcinoma and squamous cell carcinoma, pancreatic cancer and breast cancer. In benign disease of the lung and other organs, only sera from patients with tuberculosis, diffuse panbronchiolitis and fibrosing lung disease had notably elevated KL6 antigen levels. Serum levels of KL-6 antigen also bore no relationship to those of CEA, CA 19-9, CRP, and to BSR. In pleural effusions, the incidence of lung adenocarcinoma cases with elevated levels of KL3 and KL-6 antigens was 52.9% and 76.5% respectively (94.1% for one of the two). Pleural effusions from mesothehoma and matastatic lung cancer patients also had elevated levels of both antigens, whereas nonmalignant pleural effusions, including those from tuberculosis and cholesterin pleuritis, were mostly shown to have normal levels of these antigens.

These monoclonal antibodies define antigens that in combination with other tumor markers may be useful for tumor diagnosis and monitoring tumor progression.

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