高速液体クロマトグラフィーによるガラクツロン酸とオリゴガラクツロン酸の分析

ペクチン酸の酵素分解物の迅速分析を目的として、ガラクツロン酸とオリゴガラクツロン酸のHPLCによる分析について検討した。分子サイズとイオン排除を分離機構に持つ強酸性陽イオン交換樹脂のShodex SUGAR SH1821カラムを用い、0.005N硫酸を溶離液としてモノ～テトラガラクツロン酸の分離状態を調べた。カラム温度40℃、流速1.0ml/minで、トリガラクツロン酸とテトラガラクツロン酸間に部分的な重なりはあったが、ほぼ満足な結果を得た。分析所要時間は約9分であった。流速を500μl/minに下げるとさらに良好な分離が得られた。このときの分析所要時間は約18分であった。梗準試料(モノ～テトラガラクツロン酸)の検量線は広い濃度範園で良好な波線性を示した。本法による検出限界は、ガラクツロン酸ではおおよそ0.1μgであり、少なくとも0.5μg以上のガラクツロン酸が定量的に精度よく測定できることがわかった。定量精度を検定するために、ガラクツロン酸0.5～4μgに対する測定値(n=5)について標準偏差と変動係数を求めたが、前者はいずれの場合も1以下であり、後者も1～2%と低い値を示し、精度は非常に良好であることがわかった。Kluyveromyces fragilisのendo-PGによるペクチン酸の分解経過を反応初期から終期に至る段階について追跡調査した。流速1.0ml/minの条件で、モノからヘキサまでの一連のオリゴガラクツロン酸が区別でき、またそれらの数的変化の追跡も容易なことから、本法が、ペクチン酸の酵素分解物の分析や分解経過の追跡に非常に有効な分析手段であることを確認した。本法は、ペクチナーゼの作用様式やペクチン質の構造研究において、今後、ますます有用になるものと思われる。

A mixture of mono- ~ tetragalacturonic acid standards was separated by both size and ion exclusion mechanisms on a strong cation-exchange column ( 8 x 300 mm) of Shodex SUGAR SH1821 with 0.005 N sulfuric acid as elueut. Each separation was complete in 9 mill at a flow rate of 1.0 ml/min. The relationship between the peak response and concentration was strictly linear throughout the entire concentration range studied (0.5 μg/sample to 50 μg/sample of individual standards): a differential refractometer was used as detector. At an attenuation of 1 x 10^-6 RIU, the coefficients of variation of the peak height for repeated injections (n = S) were 2.3 and 1.l% for 0.5 and l.0 μg/sample of galacturonic acid, respectively. The detection limit of the uronic acid was estimated to be 0.1μg. The method was applied to follow the course of hydrolysis of pectic acid by an Endopolygalactutronase, and proved to be a very powerful tool for studying the mechanism of action of pectic enzymes. A series of oligogalacturonic acids having chain lengths of two to six units could be distinguish from each other in the digest at an early stage of the hydrolysis (10 mill after the start); the major products were tetra-, penta-, and hexagalacturonic acids. At a final stage (40 hr after the start), only three components of mono-, di-, and trigalacturonic acids were detected in the digest; the major product was trigalacturonic acid, amounting to 63% of the total pectic acid used. A total of 92% of the original pectic acid was recovered in the three components.