大環状テトラアミン亜鉛錯体を用いたリン酸エステルの加水分解 : アルカリホスファタ-ゼにおける亜鉛イオンとセリン残基の役割

Phosphodiester Hydrolysis by a New Zinc(II) Macrocyclic Tetraamine Complex with an Alcohol Pendant : Elucidation of the Roles of Ser-102 and Zinc(II) in Alkaline Phosphatase

児玉 頼光

アルカリホスファターゼ(AP)は、リン酸モノエステルの加水分解やリン酸転移反応を触媒する亜鉛酵素であり、その活性中心は2つの亜鉛イオンとそれらを固定するアミノ酸残基および亜鉛イオン近傍のセリン残基とから構成されている。現在、この酵素の反応機構として、リン酸モノエステルのリン酸がセリン残基に転移したホスホセリン中間体の存在が確認されている。この中間体の形成には、亜鉛イオンとセリン残基とから生成したアルコキシド(ZnII--OR)の関与が推察されているが明確な証拠は得られていない。また、他の多くの亜鉛酵素による加水分解反応における亜鉛イオンに配位した水酸化物イオン(ZnII-OH-)による1段階反応に比べ、中間体を経由する反応機構の有利な点も得られていない。

私は、APのセリン残基や亜鉛イオンの役割および反応機構の解明を目的として、1)ベンジルアルコールをペンダントに持つサイクレンを新規合成し、2)その亜鉛錯体を単離した。亜鉛錯体は、アルコールペンダントが亜鉛イオンに配位したアルコール型錯体およびそのアルコール型錯体のアルコールからプロトンが解離したアルコキシド型錯体を各々単離した。pH滴定法により亜鉛錯体の亜鉛イオンに配位したアルコールペンダントの酸解離定一数は7.51と決定され、アルコールは亜鉛イオンに配位することによって生理pH付近でアルコキシドを形成できることが示唆された。3)さらに、アルコキシド型錯体のX線結晶構造解析より、この錯体においてアルコキシドが亜鉛イオンに配位していることがわかった。4)亜鉛錯体とビス(4-ニトロフェニル)リン酸(BNP)との反応をNMRによって追跡した結果、この反応は、ZnII--ORがBNPを求核攻撃することによってリン酸エステルがアルコールペンダントに転移したリン酸ジエステル中間体を形成したのち、その中間体のリン酸ジエステルヘンダントが分子内ZnII-OH-によって加水分解され、リン酸モノエステルぺンダントを持つ最終生成物が生成することがわかった。最終生成物においては、リン酸モノエステルペンダントの亜鉛イオンへの配位によって亜鉛錯体の加水分解活性が失われていたこのことから、リン酸モノエステルペンダントの加水分解には、ZnII-cyclenなどの求核体の分子内へ導入が必要性であることがわかった。5)中間体は単離、同定した。

6)BNPと亜鉛錯体とから中間体が生成する反応をpH6-10で検討した。得られたシグモイド曲線から速度論的酸解離定数は7.4となり、pH滴定法から求めた亜鉛錯体の酸解離定数7.3とほぼ一致した。この結果、この反応の活性種はアルコキシド型錯体であると結論された。この反応の2次反応速度定数は6.5×104M1s-1と決定され、ZnII-methylcyclenによるBNPの加水分解反応速度定数5.2×10-6M-1s-1の125倍にもなり、ZnII--ORはZnII-OH-よりも強い求核体であることがわかった。7)中間体から最終生成物へのリン酸ジエステルぺンダント加水分解反応をpH6-10で検討した。得られたシグモイド曲線から速度論的酸解離定数は9.0となり、pH滴定法から求めた中間体の亜鉛イオンの配位水の酸解離定数9.1とほぼ一致した。この結果、この反応の活性種は分子内ZnII-OH-であると結論された。この反応の1次反応速度定数は3.5×10-5s-1と決定した。8)同様の加水分解反応が分子間で起きた場合のモデルとしてZnII-methylcyclenと4-ニトロフェニル エチル リン酸との反応(2次反応速度定数:7.9×10-7M-1s-1)を考えると、速度定数の比較から、リン酸ジエステルと亜鉛錯体との分子間反応が分子内で起きることによる有効モル濃度は45Mとなった。この結果、基質を求核体の非常に近い位置に固定することによって反応性が上がることがわかった。

これら新規亜鉛錯体を用いた実験から、APの反応機構において、1)ZnII--ORは生理pHの水溶液中で容易に生成すること、2)ZnII--ORはZII-OH-よりも求核性が強く、リン酸転移反応が容易に起きること、3)ホスホセリン中間体は、亜鉛イオン近傍にあり、ZnII-OH-による加水分解の反応性が高いこと、4)リン酸モノエステルと亜鉛錯体とは1:1の複合体を形成するため、リン酸モノエステルの加水分解には2分子の亜鉛錯体が必要であることがわかった。このモデル化学的反応の検討により生体機能の解明に大きく貢献できたと考える。

A new benzyl alcohol-pendant cyclen (cyclen = 1,4,7, 10-tetraazacyclododecane) ligand, (S)-1 -(2-hydroxy-2-phenylethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (L) has been synthesized. The complexation of L with ZnII yielded 1:1 five-coordinate complexes (isolated as its perchlorate salts with the pendant alcohol either undissociated (ZnL) or dissociated (ZnH-1L) from acidic (pH 6.0) or basic (pH 9.5) aqueous solution, respectively). The pKa value for the pendant alcohol (ZnL ⇌ ZnH-1L + H+) was determined by potentiometric pH titration to be 7.30 ± 0.02 at 35 °C with l = (1. 10 (NaNO3). The X-ray crystal study of ZnH-1L has shown two crystallographically distinct structures with the alkoxide closely coordinated at the fifth coordination site, where an average distance of Zn-O is 1.91 Å. The ZnII-bound alkoxide anion in ZnH-1L is a more reactive nucleophile than N-methylcyclen-ZnII-OH species (ZnII-Me-cyclen). In the kinetic study using ZnL in aqueous solution (pH 6.0-10.3) at 35 °C with l = 0. 10 (NaNO3), the rate-pH profile for a phosphoryl transfer reaction from bis(4-nitrophenyl)phosphate (BNP-) to ZnH-1L gave a sigmoidal curve with an inflection point at pH 7.4, which corresponds to the pKa value for ZnL ⇌ ZnH-1L + H+. The second-order rate constant kBNP of (6.5 ± 0.1) x 10-1 M-1 s-1 is 125 times greater than the corresponding value of (5.2 ± 0.2) x 10-6 M-1 s-1 for BNP- hydrolysis catalyzed by ZnII-Me-cyclen. The product of the phosphoryl transfer reaction from BNP- to ZnH-1L is the pendant alcoholphosphorylated ZnH-1L-NPP, which was isolated as its perchlorate salts ZnL-NPP by reacting ZnH-1L with BNP- in DMF. In anhydrous DMF solution, the phosphoryl transfer (kBNP of 1.1 ± 0.1 M-1 s-1 at 35 °C) is 1700 times faster than that in aqueous solution.

In the subsequent reaction of ZnL-NPP, the pendant phosphodiester undergoes an intramolecular nucleophilic attack by the ZnII-bound OH of ZnH-1L-NPP to yield a phosphomonoester product ZnL-P. From the sigmoidal rate-pH relationship (pH 7.4-10.5), the kinetic pKa value of 9.0 was estimated for ZnL-NPP ⇌ ZnH-1L-NPP + H+, which is almost the same value (pKa = 9.10 ± 0.05) determined by potentiometric pH titration at 35 °C. The first-order rate constant for the reaction ZnH-1L-NPP → ZnL-P is (3.5 ± 0. 1) x 10-5 s-1 at 35 °C with l = 0.10 (NaNO3). As a reference to this intramolecular phosphodiester hydrolysis, ethyl (4-nitrophenyl) phosphate (NEP-) was hydrolyzed by ZnII-Me-cyclen. The second-order rate constant kNEP was (7.9 ± 0.3) x 10-7 M-1 s-1 at 35 °C with l = 0. 10 (NaNO3). Thus, the intramolecular hydrolysis is 45,000 times faster than the intermolecular NEP hydrolysis with 1 mM ZnII-Me-cyclen. The present findings that demonstrate the potential of the proximate alcohol by ZnII in the initial phosphoryl transfer and the potential of the ZnII-bound water in the intramolecular phosphate hydrolysis may well serve to elucidate the collaborative functions of Ser-102 and ZnII ions in alkaline phosphatase.

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