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ID 603
file
title alternative
Molecular Cloning of Rat c-Yes Protein Tyrosine Kinase and Identification of Autophosphorylation Sites
creator
Shimizu, Masahiro
subject
がん原遺伝子
c-yes
自己リン酸化
チロシンキナーゼ
Srcファミリー
protooncogene
autophosphorylation
tyrosine kinase
Src family
NDC
Medical sciences
abstract
ラットのがん原遺伝子c-yesをラット肝臓全cDNAよりクローニングした。その遺伝子産物c-Yesは541アミノ酸から構成され, 分子量は60.6kDaで, マウス, ヒト, メダカc-Yesの一次構造と各々98,96,82%一致した。Srcファミリーチロシンキナーゼのc-Yesは, キナーゼおよびユニークドメイン内チロシン残基の分子間自己リン酸化に伴い酵素活性が促進される。ユニークドメイン内の自己リン酸化部位およびそのリン酸化が酵素活性に与える影響を調べる目的で, ラットc-Yesのユニークドメイン内自己リン酸化部位と推定されるTyr16あるいはTyr32をPheに置換した変異型(Y16F, Y32F)および野生型をSf9昆虫細胞に発現させた。3種類のラットc-Yesは2種類のカラムを用いていずれも均質に精製された。各精製酵素の比活性は, ラット肝臓より精製したc-Yesの比活性とほぼ同等であり, いずれの酵素も基質へのリン酸取り込み速度が酵素濃度の二乗と直線関係を示し, 分子間触媒機構により活性化された。野生型, Y16FおよびY32F変異型c-Yesは自己リン酸化により1モルあたりそれぞれ1.57,0.71,0.91モルのリン酸がチロシン残基に取り込まれた。自己リン酸化した3種類のc-Yesをトリプシン消化し, 二次元ペプチドマップで解析した結果, ユニークドメインのTyr32とキナーゼドメインのTyr424が主な自己リン酸化部位と判明した。しかし, 野生型, Y16FおよびY32F変異型c-Yesは自己リン酸化により4,2.5,3.9倍の酵素活性化が認められた。ユニークドメインのリン酸化は酵素活性に影響がないと考えられた。
abstract
Rat c-Yes, a Src family protein tyrosine kinase, is autophosphorylated at Tyr reisdues in the catalytic domain and in the unique domain with a concomitant increase in the the kinase activity. The site in the catalytic domain corresponds to the common autophosphorylation sites of other family members. To determine the autophosphorylation site(s) in the unique domain of rat c-Yes and their effects on the activation, I cloned the rat c-yes protooncogene and expressed wild-type, Y16F, and Y32F (Tyr was replaced with Phe) mutant c-Yes in Sf9 insect cells using the baculovirus expression system. The three forms of c-Yes were purified to homogeneity by two column chromatographies and shown to have similar specific activities and similar enzymatic properties of activation by intermolecular autophosphorylation. Pi incorporations into one mol of wild-type, Y16F, and Y32F c-Yes by autophosphorylation were 1.57,0.71,and 0.91 mol, respectively. By analyzing two-dimensional tryptic phosphopeptide maps derived from the three forms of autophosphorylated c-Yes, the major phosphorylation site in the unique domain was suggested to be Tyr32. Preincubated with ATP stimulated the kinase activities of wild-type, Y16F, and Y32F by 4.0,2.5,and 3.9-fold, respectively. This result suggests that phosphorylation in the catalytic domain (Tyr424), but not Tyr16 or Tyr32 is responsible for the activation by autophosphorylation.
journal title
Medical journal of Hiroshima Universtiy
volume
Volume 49
issue
Issue 1
start page
9
end page
24
date of issued
2001-02-28
publisher
広島大学医学出版会
contributor
国立情報学研究所
date of created
2006-03-21
issn
0018-2087
ncid
SelfDOI
language
jpn
nii type
Departmental Bulletin Paper
HU type
Departmental Bulletin Papers
DCMI type
text
format
application/pdf
text version
publisher
department
Graduate School of Biomedical Science
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