蛍光標識法による乳癌細胞のエストロゲン受容体測定

Fluorocytochemical Assay of Estrogen Receptors in Breast Cancer Cells

片岡 健

乳癌組織および穿刺吸引材料より作製した単離細胞浮遊液を用いて,フローサイトメトリー(flow cytometry)によるエストロゲン受容体(estrogen receptor;ER)の測定(以下FCM法と略す)が可能かどうか検討した。蛍光標識エストラジオールには,17β-estradiol-6carboxymethylox-1me-bovme serum albumin-fluorescein isothiocyanate (以下E2-BSA-FITC)を使用し,(1)ヒト細胞株による基礎的実験と,(2)乳癌組織および穿刺吸引材料から作製した単離細胞浮遊液を用いてのデキストラン・チャコール吸着法(dextran-coated charcoal method;DCC法)との比較を中心とした臨床的検討により,以下の結果を得た。
1)ER陽性のヒト乳癌細胞株ZR75-1と,ER陰性のヒト肺癌細胞株LK-2を用いた実験において,ER陽性細胞株ZR75-1ではE2-BSA-FITCの濃度が1×10-9Mから1×10-8Mの範囲内で,特異的結合を示す蛍光強度の濃度依存性上昇を示したが,ER陰性細胞株LK-2では濃度依存性を認めず低値のままであった。従って本試験におけるE,-BSA-FITCの最小濃度は1×10-8Mが適当と思われた。
2)ER陽性のヒト乳癌細胞株ZR75-1およびYMB-1を用いた競合的結合阻害試験において,E,-BSA-FITCのERに対する結合が抗エストロゲン剤および合成エストロゲン剤により80-90%阻害されたが,他のホルモン剤では阻害の程度が弱かった。このことからE,-BSA-FITCのERに対する特異性は高いものと考えられた。
3)乳癌組織材料においてER陽性乳癌とER陰性乳癌では,FCM法による平均蛍光強度(mean fluorescent intensity;MFI)のうちE,-BSA-FITCのERに対する真の全結合を示す平均蛍光強度(MFIT)は,ER陽性群で有意に高値であった(p<0.05)。またER陰性群のMFITのmean+2SDを基準値とすると,DCC法のER判定結果との一致率は80%(20/25)であった。
4)競合的阻害剤を加えた時の平均蛍光強度(MFIC)のヒストグラムから基準値(97.5%点)を測定し,それから求めたFCM法による染色陽性細胞率(%gated)は,ER陽性群で有意に高かった(p<0.01)が,DCC法によるER値との問には相関がなかった。
5)E2-BSA-FITCを単独に反応させた時の平均蛍光強度(MFIF)と,ジエチルスチルベストロール二リン酸(DES-DP)で阻害した時の平均蛍光強度(MFIC)のそれぞれから自家蛍光強度を差し引いた値の比を蛍光結合比(fluorescent binding ratio;FBR)とした。 FBRはDCC法によるER陽性群で有意に高値を示した(p<0.01)。 ER陰性群のFBRのM+2SDを基準値とすると,DCC法ER結果との一致率は88%(22/25)であった。またFBRの対数値は,DCC法によるERの対数値と非常によく相関した(p<0.001)。
6)穿刺吸引材料でもFCM法によるERの陽陰性の判定が可能であった。以上よりFCM法はその結果が客観的かつ定量的であり,しかも従来のDCC法と異なり,蛍光強度と染色陽性率の両面から細胞レベルで検討できるため,臨床的に有用な方法となり得るものと考えられる。

Detection of estrogen receptors (ER) was performed for human cancer cell lines and clinical materials using flow cytometry (FCM method). The results showed that: 1) Mean fluorescent intensity (MFI) indicating specific binding of fluorescence-conjugated estrogen (E2-BSA-FITC) increseased in a dose dependent manner at the range of 10-9 to 10-8 M in ER positive cell line ZR75-1 while no such dependency was seen for a ER negative cell lme LK-2. 2) Competitive inhibition of E2-BSA-FITC was observed for antiestrogen and estrogenic drugs but not for other steroids, supporting the specific binding of E2-BSA-FITC to ER. 3) True total binding (including specific as well as non-specific binding; MFIT) was significantly higher in ER positive group than in ER negative group (p < 0.05) determined by dextran-coated charcoal method (DCC method). Usmg a cut off value from ER negative group (mean MFIT plus 2SD), the coincidence of ER status between MFIT and DCC method was 80% (20/25). 4) MFI excluding autofluorescence was examined after incubation with and without an estrogen analogue; DES-DP. The ratio (fluorescent binding ratio; FBR) was found to be significantly higher in ER positive group than in ER negative group (p<0.01). Using a cut off value from the latter group (mean FBR plus 2SD), the coincidence of ER status between FBR and DCC method was 88% (22/25). In order to evaluate ER level quantitatively by the present FCM method, log ER content by DCC method was plotted against log FBR, the latter represents the difference-in MFI excluding auto fluorescence with and without DES-DP. The correlation was found to be highly significant (p<0.001). 5) If enough cell numbers were available, the aspirated materials could also be used for determination of ER status by FCM method.

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